TUGAS PRESENTASI DAN DISKUSI
BIOLOGI
MOLEKULER
TOPIK:
PEMBUATAN INSULIN DENGAN TEKNIK
DNA REKOMBINAN
Oleh:
Kelompok 4
Siti Nurjannah 115130100111001
Widya Puspitaningsih 115130100111003
Lutfan Suyudi 115130100111005
Dzunnuraini Syukri 115130101111004
Tri Cahyo Dirgahariyawan 115130101111005
M. Amriyan Nurrakhman 115130101111008
Dhita Dhuita Hayuningtyas 115130101111013
Kelas 2011 A
PROGRAM
KEDOKTERA N HEWAN
UNIVERSITAS
BRAWIJAYA
MALANG
2013
KATA
PENGANTAR
Puji syukur atas kehadirat Tuhan Yang Maha Esa, yang senantiasa
melimpahkan rahmat dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan
pembahasan kasus dan menyampaikan dalam bentuk penulisan Makalah Biologi Molekuler Pembuatan Insulin
Dengan Teknik DNA Rekombinan.
Dalam penulisan ini, penulis
menemui banyak hambatan dan kendala. Namun, berkat semangat kerja yang tak
kenal lelah serta bantuan dari beberapa pihak, penulis dapat mengatasi hambatan
dan kendala tersebut dengan baik. Pada penulisan ini penulis tidak lupa
mengucapkan terima kasih kepada:
1.
Keluarga
penulis, Ayahanda dan Ibunda tercinta yang senantiasa memberikan dorongan,
semangat, dan doa yang tiada henti demi keberhasilan putra - putrinya. Adik -
adikku yang selalu memberikan kehangatan dan keceriaan dalam setiap langkah
perjalanan hidup yang telah terlewati.
2.
Para dosen
Program Kedokteran Hewan, khususnya Dosen Biologi Molekuler : Bu Diah Kinasih atas ilmu dan materi yang telah diberikan kepada kami selama ini.
3. Teman-teman kami tercinta dan
semua saudara – saudara kami yang selalu memberikan semangat dan bantuan dalam
penyelesaian penulisan ini.
4. Semua pihak yang telah
membantu dalam penyelesaian penulisan makalah ini yang tidak mungkin penulis
sebutkan satu persatu.
Penulis menyadari bahwa dalam penulisan makalah ini
masih jauh dari sempurna, oleh karena itu penulis membuka diri untuk segala
saran dan kritik yang membangun. Akhirnya, semoga karya penulisan ini dapat
menambah wawasan dan memberi manfaat.
Malang, 29 Mei 2013
Tim Penyusun
BAB I
PENDAHULUAN
1.1
Latar Belakang
Insulin berasal dari bahasa latin “insulan” yang
berarti pulau. Secara umum insulin adalah suatu hormon yang diproduksi oleh sel
beta pulau Langerhans Kelenjar Pankreas. Insulin adalah hormon yang mengubah
glukosa menjadi glikogen yang berfungsi mengatur kadar gula darah. Hormon ini
hanya bisa diperoleh dari insulin pancreas babi atau sapi dengan jumlah
sedikit. Insulin dari pancreas hewan secara umum memang memuaskan tetapi untuk
penggunaan pada manusia dapat menimbulkan dua masalah. Pertama, adanya perbedaan
kecil dalam asam amino penyusunya yang dapat menimbulkan efek samping berupa
alergi pada beberapa penderita. Kedua, prosedur pemurnian sulit dan cemaran
berbahaya asal hewan kurang dapat dihilangkan secara sempurna.
Insulin manusia dan insulin babi
hanya beda 1 asam amino sedangkan insulin manusia dan insulin sapi beda 3 asam
amino sehingga pemakaian insulin babi kurang imunogenik dibandingkan insulin
sapi. 1 babi yang diekstraksi insulinnya hanya cukup untuk 1 orang selama 3
hari padahal saat ini ada ± 60 juta orang di dunia yang menderita diabetes tipe
1 dan diduga meningkat 5-6 % per tahunnya. Maka dari itu sekarang banyak
dikembangkan teknologi rekombinan untuk mendapatkan insulin.
Pada tahun 1981 telah ditemukan cara
produksi insulin melalui rekayasa genetika. Insulin yang diperoleh dengan cara
ini mempunyai struktur mirip dengan insulin manusia. Melalui teknologi DNA
rekombinan, insulin diproduksi menggunakan sel mikroba yang tidak pathogen. Insulin
hasil rekayasa genetika ini mempunyai efek samping yang relative sangat rendah
dibandingkan insulin yang diperoleh dari ekstrak pancreas hewan, tidak
menimbulkan efek alergi serta tidak mengandung kontaminan berbahaya.
1.2
Rumusan Masalah
a. Bagaimana cara pembuatan Insulin
dengan DNA rekombinan?
b.
Bagaimana
peran Insulin untuk pengobatan Diabetes Melitus?
1.3
Tujuan Penulisan
a. Mengetahui peran biologi molekuler
dalam bidang kesehatan yakni pengobatan DM dengan insulin rekombinan
b. Mengetahui bagaimana proses
pembuatan insulin secara rekayasa genetika tidak lagi dengan pankreas hewan
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Pengertian
Insulin adalah suatu hormon yang
diproduksi oleh sel beta pulau langerhans kelenjar pankreas. Insulin
menstimulasi pemasukan asam amino kedalam sel dan kemudian meningkatkan sintesa
protein. Insulin meningkatkan penyimpanan lemak dan mencegah penggunaan lemak
sebagai bahan energi. Insulin menstimulasi pemasukan glukosa ke dalam sel untuk
digunakan sebagai sumber energi dan membantu penyimpanan glikogen di dalam sel
otot dan hati. Insulin endogen adalah insulin yang dihasilkan dari pankreas,
sedangkan insulin eksogen adalah insulin yang disuntikan dan merupakan suatu
produk farmasi.
2.2 Indikasi Terapi dengan Insulin
Terapi
insulin dapat digunakan untuk :
- Semua
penyandang DM tipe I memerlukan insulin eksogen karena produksi insulin
oleh sel beta tidak ada atau hampir tidak ada.
- Penyandang
DM tipe II tertentu mungkin membutuhkan insulin bila terapi jenis lain
tidak dapat mengendalikan kadar glukosa darah.
- Keadaan
stress berat, seperti pada infeksi berat, tindakan pembedahan, infark
miokard akut atau stroke.
- DM
gestasional dan penyandang DM yang hamil membutuhkan insulin bila diet
saja tidak dapat mengendalikan kadar glukosa darah.
- Ketoasidosis
diabetik.
- Hiperglikemik
hiperosmolar non ketotik.
- Penyandang
DM yang mendapat nutrisi parenteral atau yang memerlukan suplemen tinggi
kalori, untuk memenuhi kebutuhan energi yang meningkat, secara bertahap
akan memerlukan insulin eksogen untuk mempertahankan kadar glukosa darah
mendekati normal selama periode resistensi insulin atau ketika terjadi
peningkatan kebutuhan insulin.
- Gangguan
fungsi ginjal atau hati yang berat.
- Kontra
indikasi atau alergi terhadap obat hipoglikemi oral.
2.3 Macam-macam Insulin Eksogen
Berdasarkan lama kerjanya, insulin
dibagi menjadi 4 macam, yaitu:
- Insulin kerja singkat
Insulin
kerja singkat contohnya
insulin regular ( Crystal Zinc Insulin / CZI ). Saat ini dikenal 2 macam
insulin CZI, yaitu dalam bentuk asam dan netral. Preparat yang ada antara lain
: Actrapid, Velosulin, Semilente. Insulin jenis ini diberikan 30 menit sebelum
makan, mencapai puncak setelah 1-3 macam dan efeknya dapat bertahan sampai 8
jam.
- Insulin Kerja Menengah
Yang dipakai saat ini adalah Netral
Protamine Hegedorn ( NPH ), MonotardÒ, InsulatardÒ. Jenis ini awal kerjanya
adalah 1.5 – 2.5 jam. Puncaknya tercapai dalam 4 – 15 jam dan efeknya dapat
bertahan sampai dengan 24 jam.
- Insulin kerja panjang
Insulin
kerja panjang merupakan
campuran dari insulin dan protamine, di absorsi dengan lambat dari tempat
penyuntikan sehingga efek yang dirasakan cukup lama, yaitu sekitar 24 – 36 jam.
Preparat: Protamine Zinc Insulin ( PZI ), Ultratard.
- Insulin infasik ( campuran )
Insulin
infasik merupakan
kombinasi insulin jenis singkat dan menengah. Preparatnya: Mixtard 30 / 40.
2.4 Fungsi Insulin
Insulin adalah hormon yang
mengendalikan gula darah. Tubuh menyerap mayoritas karbohidrat sebagai glukosa
( gula darah ). Dengan meningkatnya gula darah setelah makan, pankreas
melepaskan insulin yang membantu membawa gula darah ke dalam sel untuk
digunakan sebagai bahan bakar dalam proses metabolism atau disimpan sebagai
lemak apabila kelebihan.
2.5 Pengertian Teknologi DNA Rekombinan
Teknologi DNA rekombinan melibatkan
upaya perbanyakan gen tertentu di dalam suatu sel yang bukan sel alaminya
sehingga sering pula dikatakan sebagai kloning gen. DNA rekombinan adalah
pembentukan kombinasi materi genetik yang baru dengan cara penyisipan molekul
DNA ke dalam suatu vektor sehingga memungkinkannya untuk terintegrasi dan
mengalami perbanyakan di dalam suatu sel organisme lain yang berperan sebagai
sel inang.
Teknologi DNA rekombinan mempunyai
dua segi manfaat. Pertama, dengan mengisolasi dan mempelajari masing-masing gen
akan diperoleh pengetahuan tentang fungsi dan mekanisme kontrolnya. Kedua, teknologi
ini memungkinkan diperolehnya produk gen tertentu dalam waktu lebih cepat dan
jumlah lebih besar daripada produksi secara konvensional.
Pada dasarnya upaya untuk
mendapatkan suatu produk yang diinginkan melalui teknologi DNA rekombinan
melibatkan beberapa tahapan tertentu. Tahapan-tahapan tersebut adalah isolasi
DNA genomik/kromosom yang akan diklon, pemotongan molekul DNA menjadi sejumlah
fragmen dengan berbagai ukuran, isolasi DNA vektor, penyisipan fragmen DNA ke
dalam vektor untuk menghasilkan molekul DNA rekombinan, transformasi sel inang
menggunakan molekul DNA rekombinan, reisolasi molekul DNA rekombinan dari sel
inang, dan analisis DNA rekombinan.
- Isolasi DNA
Isolasi DNA diawali dengan pemecahan
dinding sel, yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi,
tekanan tinggi, beku-leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian
lisozim. Langkah berikutnya adalah lisis sel. Bahan-bahan sel yang relatif
lunak dapat dengan mudah diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik, sedangkan
bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat
seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS).
Pada eukariot langkah ini harus
disertai dengan perusakan membran nukleus. Setelah sel mengalami lisis,
remukan-remukan sel harus dibuang. Biasanya pembuangan remukan sel dilakukan
dengan sentrifugasi. Protein yang tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau
pelarut organik seperti kloroform untuk kemudian disentrifugasi dan dihancurkan
secara enzimatis dengan proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein dan
remukan sel masih tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk
membersihkan DNA dari RNA.
Molekul DNA yang telah diisolasi
tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan amonium asetat dan alkohol atau
dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan CsCl. Teknik isolasi DNA tersebut
dapat diaplikasikan, baik untuk DNA genomik maupun DNA vektor, khususnya
plasmid. Untuk memilih di antara kedua macam molekul DNA ini yang akan
diisolasi dapat digunakan dua pendekatan. Pertama, plasmid pada umumnya berada
dalam struktur tersier yang sangat kuat atau dikatakan mempunyai bentuk covalently closed circular (CCC),
sedangkan DNA kromosom jauh lebih longgar ikatan kedua untainya dan mempunyai
nisbah aksial yang sangat tinggi. Perbedaan tersebut menyebabkan DNA plasmid
jauh lebih tahan terhadap denaturasi apabila dibandingkan dengan DNA kromosom.
Oleh karena itu, aplikasi kondisi denaturasi akan dapat memisahkan DNA plasmid
dengan DNA kromosom.
Pendekatan kedua didasarkan atas
perbedaan daya serap etidium bromid, zat pewarna DNA yang menyisip atau
melakukan interkalasi di sela-sela basa molekul DNA. DNA plasmid akan menyerap
etidium bromid jauh lebih sedikit daripada jumlah yang diserap oleh DNA
kromosom per satuan panjangnya. Dengan demikian, perlakuan menggunakan etidium
bromid akan menjadikan kerapatan DNA kromosom lebih tinggi daripada kerapatan
DNA plasmid sehingga keduanya dapat dipisahkan melalui sentrifugasi kerapatan.
- Pemotongan DNA
Tahap kedua dalam kloning gen adalah
pemotongan molekul DNA, baik genomik maupun plasmid. Untuk memotong DNA
dibutuhkan suatu enzim restriksi. Enzim restriksi yang sering digunakan ialah
enzim restriksi tipe II. Enzim restriksi tipe II antara lain mempunyai
sifat-sifat umum yang penting sebagai berikut:
a)
mengenali
urutan tertentu sepanjang empat hingga tujuh pasang basa di dalam molekul DNA
b)
memotong
kedua untai molekul DNA di tempat tertentu pada atau di dekat tempat
pengenalannya
c)
menghasilkan
fragmen-fragmen DNA dengan berbagai ukuran dan urutan basa.
- Ligasi Molekul – molekul DNA
Pemotongan DNA genomik dan DNA
vektor menggunakan enzim restriksi harus menghasilkan ujung-ujung potongan yang
kompatibel. Artinya, fragmen-fragmen DNA genomik nantinya harus dapat
disambungkan (diligasi) dengan DNA vektor yang sudah berbentuk linier.
Ada tiga cara yang dapat digunakan
untuk meligasi fragmen-fragmen DNA secara in vitro. Pertama, ligasi
menggunakan enzim DNA ligase dari bakteri. Kedua, ligasi menggunakan DNA ligase
dari sel-sel E. coli yang telah diinfeksi dengan bakteriofag T4 atau
lazim disebut sebagai enzim T4 ligase. Jika cara yang pertama
hanya dapat digunakan untuk meligasi ujung-ujung lengket (sticky), cara yang
kedua dapat digunakan baik pada ujung lengket maupun pada ujung tumpul (blunt).
Sementara itu, cara yang ketiga telah disinggung di atas, yaitu pemberian enzim
deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3’.
Dengan untai tunggal semacam ini akan diperoleh ujung lengket buatan, yang
selanjutnya dapat diligasi menggunakan DNA ligase.
Suhu optimum bagi aktivitas DNA
ligase sebenarnya 37ºC. Akan tetapi, pada suhu ini ikatan hidrogen yang secara
alami terbentuk di antara ujung-ujung lengket akan menjadi tidak stabil dan
kerusakan akibat panas akan terjadi pada tempat ikatan tersebut. Oleh
karena itu, ligasi biasanya dilakukan pada suhu antara 4 dan 15ºC dengan waktu
inkubasi (reaksi) yang diperpanjang (sering kali hingga semalam).
Pada reaksi ligasi antara
fragmen-fragmen DNA genomik dan DNA vektor, khususnya plasmid, dapat terjadi
peristiwa religasi atau ligasi sendiri sehingga plasmid yang telah dilinierkan
dengan enzim restriksi akan menjadi plasmid sirkuler kembali. Hal ini jelas
akan menurunkan efisiensi ligasi. Untuk meningkatkan efisiensi ligasi dapat
dilakukan beberapa cara, antara lain penggunaan DNA dengan konsentrasi tinggi
(lebih dari 100µg/ml), perlakuan dengan enzim alkalin fosfatase untuk
menghilangkan gugus fosfat dari ujung 5’ pada molekul DNA yang telah terpotong,
serta pemberian molekul linker, molekul adaptor, atau penambahan enzim
deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3’
seperti telah disebutkan di atas.
- Transformasi Sel Inang
Tahap berikutnya setelah ligasi
adalah analisis terhadap hasil pemotongan DNA genomik dan DNA vektor serta
analisis hasil ligasi molekul-molekul DNA tersebut. menggunakan teknik
elektroforesis. Jika hasil elektroforesis menunjukkan bahwa fragmen-fragmen DNA
genomik telah terligasi dengan baik pada DNA vektor sehingga terbentuk molekul
DNA rekombinan, campuran reaksi ligasi dimasukkan ke dalam sel inang agar dapat
diperbanyak dengan cepat. Dengan sendirinya, di dalam campuran reaksi tersebut
selain terdapat molekul DNA rekombinan, juga ada sejumlah fragmen DNA genomik
dan DNA plasmid yang tidak terligasi satu sama lain. Tahap memasukkan campuran
reaksi ligasi ke dalam sel inang ini dinamakan transformasi karena
sel inang diharapkan akan mengalami perubahan sifat tertentu setelah dimasuki
molekul DNA rekombinan.
Mekanisme transformasi belum
sepenuhnya dapat dijelaskan. Namun, setidaknya transformasi melibatkan
tahap-tahap berikut ini. Molekul CaCl2 akan menyebabkan sel-sel
bakteri membengkak dan membentuk sferoplas yang kehilangan protein
periplasmiknya sehingga dinding sel menjadi bocor. DNA yang ditambahkan ke
dalam campuran ini akan membentuk kompleks resisten DNase dengan ion-ion Ca2+ yang
terikat pada permukaan sel. Kompleks ini kemudian diambil oleh sel selama
perlakuan kejut panas diberikan.
- Seleksi Transforman dan
Seleksi Rekombinan
Oleh karena DNA yang dimasukkan ke
dalam sel inang bukan hanya DNA rekombinan, maka kita harus melakukan seleksi
untuk memilih sel inang transforman yang membawa DNA rekombinan. Selanjutnya,
di antara sel-sel transforman yang membawa DNA rekombinan masih harus dilakukan
seleksi untuk mendapatkan sel yang DNA rekombinannya membawa fragmen sisipan
atau gen yang diinginkan.
Cara seleksi sel transforman akan
pada dasarnya ada tiga kemungkinan yang dapat terjadi setelah transformasi
dilakukan, yaitu : (1) sel inang tidak dimasuki DNA apa pun atau berarti
transformasi gagal, (2) sel inang dimasuki vektor religasi atau berarti ligasi
gagal, dan (3) sel inang dimasuki vektor rekombinan dengan/tanpa fragmen
sisipan atau gen yang diinginkan. Untuk membedakan antara kemungkinan pertama
dan kedua dilihat perubahan sifat yang terjadi pada sel inang. Jika sel inang
memperlihatkan dua sifat marker vektor, maka dapat dipastikan bahwa kemungkinan
kedualah yang terjadi.
Selanjutnya, untuk membedakan antara
kemungkinan kedua dan ketiga dilihat pula perubahan sifat yang terjadi pada sel
inang. Jika sel inang hanya memperlihatkan salah satu sifat di antara kedua
marker vektor, maka dapat dipastikan bahwa kemungkinan ketigalah yang terjadi.
Seleksi sel rekombinan yang membawa
fragmen yang diinginkan dilakukan dengan mencari fragmen tersebut menggunakan
fragmen pelacak (probe), yang pembuatannya dilakukan
secara in vitro menggunakan teknik polymerase chain reaction (PCR). Pelacakan fragmen yang
diinginkan antara lain dapat dilakukan melalui cara yang dinamakan hibridisasi
koloni. Koloni-koloni
sel rekombinan ditransfer ke membran nilon, dilisis agar isi selnya keluar,
dibersihkan protein dan remukan sel lainnya hingga tinggal tersisa DNAnya saja.
Selanjutnya, dilakukan fiksasi DNA dan perendaman di dalam larutan pelacak.
Posisi-posisi DNA yang terhibridisasi oleh fragmen pelacak dicocokkan dengan
posisi koloni pada kultur awal (master plate). Dengan demikian,
kita bisa menentukan koloni-koloni sel rekombinan yang membawa fragmen yang
diinginkan.
BAB III
PEMBAHASAN
3.1 Membuat Insulin Manusia dengan
Teknik DNA Rekombinan
Sejak Banting dan Best menemukan
hormon insulin pada tahun 1921, pasien diabetes mellitus yang mengalami
peningkatan kadar gula darah disebabkan gangguan produksi insulin, telah
diterapi dengan menggunakan insulin yang berasal dari kelenjar pankreas hewan.
Meskipun insulin sapi dan babi mirip
dengan insulin manusia, namun komposisinya sedikit berbeda. Akibatnya, sejumlah
sistem kekebalan tubuh pasien menghasilkan antibodi terhadap insulin babi dan
sapi yang berusaha menetralkan dan mengakibatkan respon inflamasi pada tempat
injeksi. Selain itu efek samping dari insulin sapi dan babi ini adalah
kekhawatiran adanya komplikasi jangka panjang dari injeksi zat asing yang
rutin.
Faktor-faktor ini menyebabkan
peneliti mempertimbangkan untuk membuat Humulin dengan memasukkan gen insulin
ke dalam vektor yang cocok, yaitu sel bakteri E. coli, untuk memproduksi
insulin yang secara kimia identik dan dapat secara alami diproduksi. Hal ini
telah dicapai dengan menggunakan teknologi DNA rekombinan.
Secara kimia, insulin adalah protein
kecil sederhana yang terdiri dari 51 asam amino, 30 di antaranya merupakan satu
rantai polipeptida, dan 21 lainnya yang membentuk rantai kedua. Kedua rantai
dihubungkan oleh ikatan disulfida.
Kode genetik untuk insulin ditemukan
dalam DNA di bagian atas lengan pendek dari kromosom kesebelas yang berisi 153
basa nitrogen (63 dalam rantai A dan 90 dalam rantai B). DNA yang membentuk
kromosom, terdiri dari dua heliks terjalin yang dibentuk dari rantai
nukleotida, masing-masing terdiri dari gula deoksiribosa, fosfat dan nitrogen.
Ada empat basa nitrogen yang berbeda yaitu adenin, timin, sitosin dan guanin.
Sintesis protein tertentu seperti insulin ditentukan oleh urutan dasar tersebut
yang diulang.
3.2 Proses Produksi
Escherichia coli (E. coli), penghuni
saluran pencernaan manusia, adalah ‘pabrik’ yang digunakan dalam rekayasa genetika
insulin. Ketika bakteri bereproduksi, gen insulin direplikasi bersama dengan
plasmid. E. coli seketika memproduksi enzim yang dengan cepat mendegradasi
protein asing seperti insulin. Hal tersebut dapat dicegah dengan cara
menggunakan E. coli strain mutan yang sedikit mengandung enzim ini. Pada E. coli,
B-galaktosidase adalah enzim yang mengontrol transkripsi gen. Untuk membuat
bakteri memproduksi insulin, gen insulin perlu terikat pada enzim ini.
Enzim restriksi secara alami
diproduksi oleh bakteri. Enzim restriksi bertindak seperti pisau bedah biologi,
hanya mengenali rangkaian nukleotida tertentu, misal salah satunya rangkaian
kode untuk insulin. Hal tersebut memungkinkan peneliti untuk memutuskan
pasangan basa nitrogen tertentu dan menghapus bagian DNA yang berisi kode
genetik dari kromosom sebuah organisme sehingga dapat memproduksi insulin.
Sedangkan DNA ligase adalah suatu enzim yang berfungsi sebagai perekat genetik
dan pengelas ujung nukleotida.
Langkah pertama pembuatan humulin
adalah mensintesis rantai DNA yang membawa sekuens nukleotida spesifik yang
sesuai karakteristik rantai polipeptida A dan B dari insulin. Urutan DNA yang
diperlukan dapat ditentukan karena komposisi asam amino dari kedua rantai telah
dipetakan. Enam puluh tiga nukleotida yang diperlukan untuk mensintesis rantai
A dan sembilan puluh untuk rantai B, ditambah kodon pada akhir setiap rantai
yang menandakan pengakhiran sintesis protein.
Antikodon menggabungkan asam amino,
metionin, kemudian ditempatkan di setiap awal rantai yang memungkinkan
pemindahan protein insulin dari asam amino sel bakteri itu. ‘Gen’ sintetik
rantai A dan B kemudian secara terpisah dimasukkan ke dalam gen untuk enzim
bakteri, B-galaktosidase, yang dibawa dalam plasmid vektor tersebut. Pada tahap
ini, sangat penting untuk memastikan bahwa kodon gen sintetik kompatibel dengan
B-galaktosidase. Plasmid rekombinan tersebut kemudian dimasukkan ke dalam sel
E. coli.
Praktis penggunaan teknologi DNA
rekombinan dalam sintesis insulin manusia membutuhkan jutaan salinan plasmid
bakteri yang telah digabungkan dengan gen insulin dalam rangka untuk
menghasilkan insulin. Gen insulin diekspresikan bersama dengan sel mereplikasi
galaktosidase-B di dalam sel yang sedang menjalani mitosis.
Protein yang terbentuk, sebagian
terdiri dari B-galaktosidase, bergabung ke salah satu rantai insulin A atau B.
Rantai insulin A dan rantai B kemudian diekstraksi dari fragmen B-galaktosidase
dan dimurnikan.
Kedua rantai dicampur dan
dihubungkan kembali dalam reaksi yang membentuk jembatan silang disulfida,
menghasilkan Humulin murni (insulin manusia sintetis).
3.3 Implikasi Biologis dari Rekayasa Genetika Humulin
Rekombinan
Humulin merupakan protein hewani
yang dibuat dari bakteri sedemikian rupa sehingga strukturnya benar-benar
identik dengan molekul alami. Hal ini akan mengurangi kemungkinan komplikasi
yang disebabkan produksi antibodi oleh tubuh manusia. Dalam studi kimia dan
farmakologi, insulin rekombinan DNA manusia yang diproduksi secara komersil
telah terbukti bisa dibedakan dari insulin pankreas manusia. Awalnya, kesulitan
utama yang dihadapi adalah kontaminasi produk akhir oleh sel inang, sehingga
meningkatkan resiko kontaminasi dalam kaldu fermentasi. Bahaya ini diatasi
dengan ditemukannya proses pemurnian. Ketika dilakukan tes pada produk akhir
insulin, termasuk teknik terbaik radio-immuno assay, tidak ada
‘kotoran’ yang terdeteksi.
Seluruh prosedur, sekarang dilakukan
dengan menggunakan sel ragi sebagai media pertumbuhan, karena sel ragi dapat
menghasilkan sebuah molekul insulin manusia yang hampir lengkap dengan struktur
tiga dimensi yang sempurna. Ini meminimalkan kebutuhan untuk prosedur pemurnian
kompleks dan mahal.
3.4 Pemberian Insulin Pada Penderita Diabetes Mellitus
Insulin adalah suatu hormon yang
secara alami dihasilkan oleh pulau pulau langerhans pankreas. Insulin memungkinkan
sel – sel tubuh mengabsorbsi glukosa dari darah untuk digunakan sebagai sumber
energy, diubah menjadi molekul lain yang diperlukan, atau untuk disimpan.
Insulin juga merupakan sinyal control untama konversi glukosa menjadi glikogen
untuk penyimpanan internal di hati dan sel otot. Bila jumlah insulin yang
tersedia tidak mencukupi, sel tidak merespon adanya insulin (tidak sensitif
atau resisten), atau bila insulin itu sendiri tidak diproduksi oleh sel – sel
beta akibat rusaknya sel–sel beta pada pancreas, maka glukosa tidak dapat
dimanfaatkan oleh sel tubuh ataupun disimpan dalam bentuk cadangan makanan
dalam hati maupun sel otot. Akibat yang terjadi adalah peningkatan kadar
glukosa dalam darah, penurunan sintesis protein, dan gangguan proses – proses metabolisme
dalam tubuh. Hormon ini bekerja mengatur kadar glukosa dalam darah dengan cara
mempermudah masuknya glukosa ke dalam semua jaringan tubuh.
Jika jumlah insulin yang diproduksi
tidak memadai, kadar glukosa dalam darah akan meningkat dan sebagai akibatnya
glukosa akan di ekskresi dalam urine. Defisiensi insulin dalam manusia
menyebabkan penyakit genetik diabetes mellitus jenis I atau disebut IDDM
(Insulin Dependent Diabetes Mellitus). Bila tidak diobati penyakit ini akan
membahayakan kehamilan, bahkan dapat menyebabkan kematian.
Pemberian injeksi insulin secara
teratur dalam meningkatkan kadar insulin dalam darah penderita dapat
meminimumkan komplikasi. Pengobatan ini hanya mungkin dilaksanakan bila insulin
tersedia dalam jumlah besar dengan kemurnian dan mutu yang baik. Pemberian
insulin kepada penderita diabetes hanya bisa dilakukan dengan cara suntikan,
jika diberikan melalui oral insulin akan rusak didalam lambung. Setelah
disuntikan, insulin akan diserap kedalam aliran darah dan dibawa ke seluruh
tubuh. Disini insulin akan bekerja menormalkan kadar gula darah (blood glucose)
dan merubah glucose menjadi energi. Perlu diperhatikan daerah mana saja yang
dapat dijadikan tempat menyuntikkan insulin. Bila kadar glukosa darah tinggi,
sebaiknya disuntikkan di daerah perut dimana penyerapan akan lebih cepat. Namun
bila kondisi kadar glukosa pada darah rendah, hindarilah penyuntikkan
pada daerah perut.
Secara urutan, area proses
penyerapan paling cepat adalah dari perut, lengan atas dan paha. Insulin akan
lebih cepat diserap apabila daerah suntikkan digerak-gerakkan. Penyuntikkan
insulin pada satu daerah yang sama dapat mengurangi variasi penyerapan.
Penyuntikkan insulin selalu di daerah yang sama dapat merangsang terjadinya
perlemakan dan menyebabkan gangguan penyerapan insulin. Daerah suntikkan
sebaiknya berjarak 1 inchi (+ 2,5 cm) dari daerah sebelumnya.
Lakukanlah rotasi di dalam satu daerah selama satu minggu, lalu baru pindah ke
daerah yang lain.
Kerja insulin dalam tubuh
dipengaruhi oleh beberapa faktor di antaranya :
a.
Dosis
Semakin tinggi dosisnya maka semakin
cepat aksinya.
- Tempat injeksi
Pada umumnya insulin diberikan
dengan injeksi menembus kulit. Pada pemberian intravena aksinya cepat, pad
transdermal atau secara subkutan maka pada otot terjadi degradasi insulin
20-25%. Makanya harus diperhitungkan untuk mendapatkan dosis yang tepat.
Kebanyakan insulin diinjeksikan pada perut (intrperional). Jarum untuk injeksi
insulin kecil sekali dan pendek (0,5 - 1 cm). Dapat juga menggunakan implant
pada dada yang dapat mensuplai insulin sedikit demi sedkit.
- Kehadiran antibodi insulin
Hal ini terutama pada penggunaan
hewan sebagai insulin. Jika digunakan insulin dari luar dikhawatirkan terjadi
reaksi antigen antibodi maupun perusakan lain, kecuali pada penderita autoimun.
- Aktivitas fisik
Semakin banyak aktivitas fisik yang
kita lakukan maka kita perlu energi (dari glukosa) yang semakin besar
sehingga tidak perlu aksi insulin yang ekstra untuk mengubah glukosa menjadi
glikogen (insulin yang diperlukan semakin sedikit).
Insulin dapat dibedakan atas dasar:
- Waktu kerja insulin (onset),
yaitu waktu mulai timbulnya efek insulin sejak disuntikan.
- Puncak kerja insulin, yaitu
waktu tercapainya puncak kerja insulin.
- Lama kerja insulin (durasi),
yaitu waktu dari timbulnya efek insulin sampai hilangnya efek insulin.
Terdapat 4 buah insulin eksogen yang
diproduksi dan dikategorikan berdasarkan puncak dan jangka waktu efeknya.
Berikut keterangan jenis insulin eksogen :
a.
Insulin
Eksogen kerja cepat.
Bentuknya berupa larutan jernih,
mempunyai onset cepat dan durasi pendek. Yang termasuk di sini adalah insulin
regular (Crystal Zinc Insulin / CZI ). Saat ini dikenal 2 macam insulin CZI,
yaitu dalam bentuk asam dan netral. Preparat yang ada antara lain : Actrapid,
Velosulin, Semilente. Insulin jenis ini diberikan 30 menit sebelum makan,
mencapai puncak setelah 1– 3 macam dan efeknya dapat bertahan samapai 8 jam.
b.
Insulin
Eksogen kerja sedang.
Bentuknya terlihat keruh karena
berbentuk hablur-hablur kecil, dibuat dengan menambahkan bahan yang dapat
memperlama kerja obat dengan cara memperlambat penyerapan insulin kedalam
darah. Yang dipakai saat ini adalah Netral Protamine Hegedorn (NPH), MonotardÒ,
InsulatardÒ. Jenis ini awal kerjanya adalah 1.5 – 2.5 jam. Puncaknya tercapai
dalam 4 – 15 jam dan efeknya dapat bertahan sampai dengan 24 jam.
c.
Insulin
Eksogen campur antara kerja cepat & kerja sedang (Insulin premix)
Yaitu insulin yang mengandung
insulin kerja cepat dan insulin kerja sedang. Insulin ini mempunyai onset cepat
dan durasi sedang (24 jam). Preparatnya: Mixtard 30 / 40
d.
Insulin
Eksogen kerja panjang (lebih dari 24 jam).
Merupakan campuran dari insulin dan
protamine, diabsorsi dengan lambat dari tempat penyuntikan sehingga efek yang
dirasakan cukup lam, yaitu sekitar 24 – 36 jam. Preparat: Protamine Zinc
Insulin ( PZI ), Ultratard.
Karakteristik farmakokinetik: pendek, intermediet dan
long-acting sediaan insulin
|
Kategori
|
Onset
(jam)
|
Aktivitas
puncak (jam)
|
Durasi
(jam)
|
|
Aksi
pendek
|
0,5-1
|
2-5
|
6-8
|
|
Aksi
menengah
|
2
|
4-12
|
Sampai
24
|
|
Aksi
lama
|
4
|
10-20
|
Sampai
36
|
Pemberian insulin:
- short
acting
: diberi 0,5-1 jam sebelum maakan
- intermediet acting : diberi 2 jam sebelum
makan
- long
acting
: diberi 4 jam sebelum makan
Pemberian preparat insulin perlu
diatur seperti di atas supaya saat kadar glukosa dalam tubuh tinggi (mencapai
puncak) maka kadar insulin juga sudah tinggi, jadi harus seimbang. jika kadar
insulin tinggi kadar glukosa darah rendah maka akan terjadi shock. Jika kadar
insulin rendah tetapi kada glukosa darah tinggi maka terjadi kelebihan gula
(diabetes).
BAB IV
KESIMPULAN
Insulin mempunyai beberapa pengaruh
dalam jaringan tubuh. Insulin menstimulasi pemasukan asam amino kedalam sel
kemudian meningkatkan sintesa protein. Insulin meningkatkan penyimpanan lemak
dan mencegah penggunaan lemak sebagai bahan energi. Insulin menstimulasi
pemasukan glukosa kedalam sel untuk digunakan sebagai sumber energi dan
membantu penyimpanan glikogen didalam sel otot dan hati. Insulin endogin adalah
insulin yang dihasilkan oleh pankreas, sedangkan insulin eksogin adalah insulin
yang disuntikkan dan merupakan suatu produk farmasi.
DAFTAR PUSTAKA
Ansel, Howard C. 2005. Pengantar
Bentuk Sediaan Farmasi Edisi ke-empat. UIP: Jakarta
Susan L.et al. 2005. Genetika
Edisi IV. Erlangga: Jakarta
http://id.shvoong.com/medicine-and-health
Tidak ada komentar:
Posting Komentar